Cos'è CRISPR?

La tecnologia CRISPR è uno strumento semplice ma potente per la modifica dei genomi. Consente ai ricercatori di alterare facilmente le sequenze di DNA e modificare la funzione del gene. Le sue numerose potenziali applicazioni includono la correzione di difetti genetici, il trattamento e la prevenzione della diffusione di malattie e il miglioramento delle colture. Tuttavia, la sua promessa solleva anche preoccupazioni etiche.

Nell'uso popolare, "CRISPR" (pronunciato "crisper") è l'abbreviazione di "CRISPR-Cas9". I CRISPR sono tratti di DNA specializzati. La proteina Cas9 (o "associata a CRISPR") è un enzima che agisce come un paio di forbici molecolari, in grado di tagliare filamenti di DNA.

La tecnologia CRISPR è stata adattata dai meccanismi di difesa naturale di batteri e archaea (il dominio dei microrganismi unicellulari). Questi organismi utilizzano RNA derivato da CRISPR e varie proteine ​​Cas, inclusa Cas9, per sventare gli attacchi di virus e altri corpi estranei. Lo fanno principalmente sminuzzando e distruggendo il DNA di un invasore straniero. Quando questi componenti vengono trasferiti in altri organismi più complessi, ciò consente la manipolazione dei geni o la "modifica".

Fino al 2017, nessuno sapeva davvero come fosse questo processo. In un articolo pubblicato il 10 novembre 2017, sulla rivista Nature Communications, un team di ricercatori guidato da Mikihiro Shibata dell'Università di Kanazawa e Hiroshi Nishimasu dell'Università di Tokyo ha mostrato come appare quando un CRISPR è in azione per il primo tempo. [Una nuova GIF mozzafiato mostra CRISPR Chewing Up DNA]

CRISPR-Cas9: i principali attori

CRISPR: "CRISPR "sta per" cluster di brevi ripetizioni palindromiche regolarmente interspaziate ". È una regione specializzata del DNA con due caratteristiche distinte: la presenza di ripetizioni nucleotidiche e spaziatori. Sequenze ripetute di nucleotidi - i mattoni del DNA - sono distribuite in un CRISPR Gli spaziatori sono frammenti di DNA che sono intervallati da queste sequenze ripetute.

Nel caso dei batteri, i distanziatori sono presi da virus che in precedenza hanno attaccato l'organismo. Fungono da banca di ricordi, che consente ai batteri di riconoscere i virus e combattere attacchi futuri.

Ciò è stato dimostrato per la prima volta sperimentalmente da Rodolphe Barrangou e da un team di ricercatori di Danisco, un'azienda di ingredienti alimentari. In un articolo del 2007 pubblicato sulla rivista Science, i ricercatori hanno utilizzato Streptococcus thermophilus batteri, che si trovano comunemente nello yogurt e in altri prodotti lattiero-caseari, come modello. Hanno osservato che dopo un attacco di virus, nuovi spaziatori sono stati incorporati nella regione CRISPR. Inoltre, la sequenza del DNA di questi spaziatori era identica a parti del genoma del virus. Hanno anche manipolato gli spaziatori estraendoli o inserendo nuove sequenze di DNA virale. In questo modo, sono stati in grado di alterare la resistenza dei batteri a un attacco di un virus specifico. Pertanto, i ricercatori hanno confermato che i CRISPR svolgono un ruolo nella regolazione dell'immunità batterica.

CRISPR RNA (crRNA): Una volta che uno spaziatore è stato incorporato e il virus attacca di nuovo, una parte del CRISPR viene trascritta ed elaborata in CRISPR RNA, o "crRNA". La sequenza nucleotidica del CRISPR funge da templato per produrre una sequenza complementare di RNA a filamento singolo. Ogni crRNA è costituito da una ripetizione nucleotidica e una porzione spaziatore, secondo una recensione del 2014 di Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier, pubblicata sulla rivista Science.

Cas9: La proteina Cas9 è un enzima che taglia il DNA estraneo.

La proteina si lega tipicamente a due molecole di RNA: crRNA e un'altra chiamata tracrRNA (o "crRNA transattivante"). I due quindi guidano Cas9 al sito di destinazione dove farà il suo taglio. Questa estensione di DNA è complementare a un tratto di 20 nucleotidi del crRNA.

Utilizzando due regioni separate, o "domini" sulla sua struttura, Cas9 taglia entrambi i filamenti della doppia elica del DNA, creando ciò che è noto come "rottura a doppio filamento", secondo l'articolo di Science del 2014.

C'è un meccanismo di sicurezza integrato, che assicura che Cas9 non si limiti a tagliare ovunque in un genoma. Brevi sequenze di DNA note come PAM ("motivi adiacenti protospacer") servono come tag e si trovano adiacenti alla sequenza di DNA bersaglio. Se il complesso Cas9 non vede un PAM accanto alla sua sequenza di DNA bersaglio, non taglierà. Questa è una possibile ragione per cui Cas9 non attacca mai la regione CRISPR nei batteri, secondo una revisione del 2014 pubblicata su Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 come strumento di modifica del genoma

I genomi di vari organismi codificano una serie di messaggi e istruzioni all'interno delle loro sequenze di DNA. L'editing del genoma implica la modifica di quelle sequenze, cambiando così i messaggi. Questo può essere fatto inserendo un taglio o una rottura nel DNA e ingannando i meccanismi naturali di riparazione del DNA di una cellula per introdurre i cambiamenti desiderati. CRISPR-Cas9 fornisce un mezzo per farlo.

Nel 2012 sono stati pubblicati due documenti di ricerca cardine sulle riviste Science e PNAS, che hanno contribuito a trasformare il CRISPR-Cas9 batterico in un semplice strumento di modifica del genoma programmabile.

Gli studi, condotti da gruppi separati, hanno concluso che Cas9 potrebbe essere diretto a tagliare qualsiasi regione del DNA. Questo potrebbe essere fatto semplicemente cambiando la sequenza nucleotidica del crRNA, che si lega a un bersaglio di DNA complementare. Nell'articolo di Science del 2012, Martin Jinek e colleghi hanno ulteriormente semplificato il sistema fondendo crRNA e tracrRNA per creare un unico "RNA guida". Pertanto, l'editing del genoma richiede solo due componenti: un RNA guida e la proteina Cas9.

"Operativamente, si progetta un tratto di 20 coppie di basi [nucleotidi] che corrispondono a un gene che si desidera modificare", ha detto George Church, professore di genetica alla Harvard Medical School. Viene costruita una molecola di RNA complementare a queste 20 coppie di basi. Church ha sottolineato l'importanza di assicurarsi che la sequenza nucleotidica si trovi solo nel gene bersaglio e in nessun'altra parte del genoma. "Quindi l'RNA più la proteina [Cas9] taglierà - come un paio di forbici - il DNA in quel sito, e idealmente in nessun altro", ha spiegato.

Una volta tagliato il DNA, i meccanismi di riparazione naturale della cellula si attivano e lavorano per introdurre mutazioni o altre modifiche al genoma. Ci sono due modi in cui ciò può accadere. Secondo l'Huntington's Outreach Project della Stanford (Università), un metodo di riparazione prevede l'incollaggio dei due tagli. Questo metodo, noto come "unione di estremità non omologa", tende a introdurre errori. I nucleotidi vengono inseriti o eliminati accidentalmente, provocando mutazioni che potrebbero alterare un gene. Nel secondo metodo, la rottura viene riparata riempiendo lo spazio con una sequenza di nucleotidi. Per fare ciò, la cellula utilizza un breve filamento di DNA come modello. Gli scienziati possono fornire il modello di DNA di loro scelta, scrivendo in tal modo qualsiasi gene desiderino o correggendo una mutazione.

Utilità e limitazioni

CRISPR-Cas9 è diventato popolare negli ultimi anni. Church osserva che la tecnologia è facile da usare ed è circa quattro volte più efficiente del precedente miglior strumento di modifica del genoma (chiamato TALENS).

Nel 2013, i primi rapporti sull'utilizzo di CRISPR-Cas9 per modificare cellule umane in un ambiente sperimentale sono stati pubblicati dai ricercatori dei laboratori di Church e Feng Zhang del Broad Institute del Massachusetts Institute of Technology e di Harvard. Studi che utilizzano modelli in vitro (laboratorio) e animali di malattie umane hanno dimostrato che la tecnologia può essere efficace nella correzione dei difetti genetici. Esempi di tali malattie includono la fibrosi cistica, la cataratta e l'anemia di Fanconi, secondo un articolo di revisione del 2016 pubblicato sulla rivista Nature Biotechnology. Questi studi aprono la strada per applicazioni terapeutiche negli esseri umani.

"Penso che la percezione pubblica di CRISPR sia molto focalizzata sull'idea di utilizzare l'editing genetico clinicamente per curare le malattie", ha detto Neville Sanjana del New York Genome Center e assistente professore di biologia, neuroscienze e fisiologia alla New York University. "Questa è senza dubbio una possibilità entusiasmante, ma questo è solo un piccolo pezzo."

La tecnologia CRISPR è stata applicata anche nell'industria alimentare e agricola per progettare colture probiotiche e vaccinare colture industriali (per lo yogurt, ad esempio) contro i virus. Viene anche utilizzato nelle colture per migliorare la resa, la tolleranza alla siccità e le proprietà nutritive.

Un'altra potenziale applicazione è la creazione di unità geniche. Questi sono sistemi genetici, che aumentano le possibilità che un particolare tratto si trasmetta da genitore a prole. Alla fine, nel corso delle generazioni, il tratto si diffonde attraverso intere popolazioni, secondo l'Istituto Wyss. Le pulsioni geniche possono aiutare a controllare la diffusione di malattie come la malaria aumentando la sterilità tra il vettore della malattia - la femmina Anopheles gambiae zanzare - secondo l'articolo della Nature Biotechnology del 2016. Inoltre, i gene drive potrebbero essere utilizzati anche per sradicare le specie invasive e invertire la resistenza ai pesticidi e agli erbicidi, secondo un articolo del 2014 di Kenneth Oye e colleghi, pubblicato sulla rivista Science.

Tuttavia, CRISPR-Cas9 non è privo di inconvenienti.

"Penso che la più grande limitazione di CRISPR sia che non è efficiente al cento per cento", ha detto Church. Inoltre, le efficienze di modifica del genoma possono variare. Secondo l'articolo di Science del 2014 di Doudna e Charpentier, in uno studio condotto sul riso, l'editing genetico si è verificato in quasi il 50% delle cellule che hanno ricevuto il complesso Cas9-RNA. Considerando che, altre analisi hanno dimostrato che, a seconda dell'obiettivo, l'efficienza di editing può raggiungere l'80% o più.

C'è anche il fenomeno degli "effetti fuori bersaglio", in cui il DNA viene tagliato in siti diversi dal bersaglio previsto. Questo può portare all'introduzione di mutazioni indesiderate. Inoltre, Church ha osservato che anche quando il sistema taglia in modo mirato, c'è la possibilità di non ottenere una modifica precisa. Ha chiamato questo "vandalismo genomico".

Stabilire dei limiti

Le molte potenziali applicazioni della tecnologia CRISPR sollevano interrogativi sui meriti etici e le conseguenze della manomissione dei genomi.

Nell'articolo di Science del 2014, Oye e colleghi sottolineano il potenziale impatto ecologico dell'uso dei gene drive. Un tratto introdotto potrebbe diffondersi oltre la popolazione target ad altri organismi attraverso l'incrocio. Le pulsioni geniche potrebbero anche ridurre la diversità genetica della popolazione target.

Apportare modifiche genetiche agli embrioni umani e alle cellule riproduttive come lo sperma e le uova è noto come editing della linea germinale. Poiché le modifiche a queste cellule possono essere trasmesse alle generazioni successive, l'utilizzo della tecnologia CRISPR per apportare modifiche alla linea germinale ha sollevato una serie di preoccupazioni etiche.

L'efficacia variabile, gli effetti fuori target e le modifiche imprecise pongono tutti rischi per la sicurezza. Inoltre, molto è ancora sconosciuto alla comunità scientifica. In un articolo del 2015 pubblicato su Science, David Baltimore e un gruppo di scienziati, esperti di etica ed esperti legali notano che l'editing della linea germinale aumenta la possibilità di conseguenze non intenzionali per le generazioni future "perché ci sono limiti alla nostra conoscenza della genetica umana, delle interazioni gene-ambiente, e le vie della malattia (inclusa l'interazione tra una malattia e altre condizioni o malattie nello stesso paziente). "

Altre preoccupazioni etiche sono più sfumate. Dobbiamo apportare modifiche che potrebbero influenzare fondamentalmente le generazioni future senza il loro consenso? E se l'uso dell'editing della linea germinale vira dall'essere uno strumento terapeutico a uno strumento di miglioramento per varie caratteristiche umane??

Per affrontare queste preoccupazioni, le Accademie nazionali di scienze, ingegneria e medicina hanno redatto un rapporto completo con linee guida e raccomandazioni per l'editing del genoma.

Sebbene le Accademie Nazionali sollecitino cautela nel perseguire l'editing della linea germinale, sottolineano che "cautela non significa divieto". Raccomandano che la modifica della linea germinale venga eseguita solo su geni che portano a malattie gravi e solo quando non ci sono altre alternative di trattamento ragionevoli. Tra gli altri criteri, sottolineano la necessità di disporre di dati sui rischi e sui benefici per la salute e la necessità di una supervisione continua durante gli studi clinici. Raccomandano inoltre di seguire le famiglie per più generazioni.

Ricerca recente

Ci sono stati molti progetti di ricerca recenti basati su CRISPR. "Il ritmo delle scoperte della ricerca di base è esploso, grazie a CRISPR", ha detto il biochimico ed esperto di CRISPR Sam Sternberg, il leader del gruppo di sviluppo tecnologico a Berkeley, con sede in California, Caribou Biosciences Inc., che sta sviluppando soluzioni basate su CRISPR per la medicina, agricoltura e ricerca biologica.

Ecco alcuni dei risultati più recenti:

• Nell'aprile 2017, un team di ricercatori ha pubblicato una ricerca sulla rivista Science secondo cui avevano programmato una molecola CRISPR per trovare ceppi di virus, come Zika, nel siero del sangue, nelle urine e nella saliva.
• Il 2 agosto 2017, gli scienziati hanno rivelato sulla rivista Nature di aver rimosso un difetto di malattia cardiaca in un embrione utilizzando con successo CRISPR.
• Il 2 gennaio 2018, i ricercatori hanno annunciato che potrebbero essere in grado di fermare funghi e altri problemi che minacciano la produzione di cioccolato utilizzando CRISPR per rendere le piante più resistenti alle malattie.
• Il 16 aprile 2018, i ricercatori hanno aggiornato CRISPR per modificare migliaia di geni contemporaneamente, secondo una ricerca pubblicata dalla rivista BioNews.

Segnalazione aggiuntiva di Alina Bradford, collaboratrice.

Risorse addizionali

• Broad Institute: una cronologia del lavoro cardine su CRISPR
• Notizie di ingegneria genetica e biotecnologia: CRISPR-Cas9 10000 volte migliorato dai nucleotidi sintetici
• Broad Institute: domande e risposte su CRISPR